Annexe 2

Annex II

Mètodes oficials d'anàlisi per a la detecció de triquines, condicions dels laboratoris i de certs materials o equipaments

Capítol I. Mètodes oficials d'anàlisi

Examen triquinoscòpic

a) Instrumental i material: Triquinoscopi de làmpada incandescent que permeti un augment de 50 i 80 o 100 vegades la imatge real. Placa compressora formada per dues plaquetes de vidre que puguin comprimir- se l'una contra l'altra, una de les quals ha d'estar dividida en zones iguals (es recomana adquirir i utilitzar una càmera de "Mac-master"). Unes tisores petites corbes. Una pinça petita. Un ganivet per tallar mostres. Diversos recipients petits i numerats destinats a la recollida de les mostres. Un comptagotes. Un vas o recipient que contingui àcid acètic i un altre que contingui una solució de potassa càustica per aclarir en cas de presència de calcificacions o per estovar, quan les carns estiguin seques (envellides).

b) Preparació de les mostres: Quan les mostres procedeixin d'animals sencers (canals), cal agafar una mostra del tamany d'una avellana de cada un dels pilars del diafragma en la zona de transició entre la part muscular i la part tendinosa. Quan únicament es disposi d'un pilar del diafragma, cal agafar una mostra del tamany del doble d'una avellana i en cas que no es disposi de pilars del diafragma, cal agafar una mostra d'aproximadament el tamany d'una avellana de la part del diafragma situada prop de les costelles o dels músculs de la llengua o dels músculs mastegadors o dels músculs de la paret abdominal. Quan les mostres procedeixin de trossos de carn, cal agafar de cada tros de les tres mostres, una mostra d'aproximadament el tamany d'una avellana dels músculs esquelètics que continguin poc greix, i en la mesura del possible, prop dels ossos o dels tendons.

c) Mode operatiu: De cadascuna de les mostres preses en les canals senceres abans descrites, han de tallar-se, en cas de disposar dels dos pilars del diafragma, set fragments del tamany d'un grà d'avellana, és a dir, 14 fragments en diferents llocs, i en la mesura del possible, en la zona intermèdia entre múscul i tendó.

Un cop obtinguts els fragments, cal comprimir-los amb la placa compressora, de manera que puguin llegir-se fàcilment a través de les preparacions, el caràcters d'impremta normals.

Quan la carn dels trossos que es vulgui examinar estigui seca o envellida, les preparacions s'han d'amarar, durant 10-20 minuts, en una solució de potassa diluïda en dos volums d'aigua abans de comprimir-los.

Quan, en el cas de canals senceres, les dues mostres procedeixin de la part del diafragma situada prop de les costelles o de l'estèrnum, de la musculatura de la llengua o dels músculs mastegadors o, fins i tot, dels músculs abdominals, han de tallar-se 14 fragments d'aproximadament el tamany d'un grà d'avellana, de cada mostra, és a dir 28 fragments en total.

En el cas de trossos de carn, de cadascuna de les tres mostres, s'ha de tallar quatre fragments d'aproximadament el tamany d'un grà d'avellana, és a dir, 12 fragments en total.

L'examen al triquinoscopi s'ha de fer de manera que cada preparació sigui examinada lenta i acuradament.

Quan durant l'examen triquinoscopic es detectin imatges sospitoses que no puguin determinar-se amb certesa, ni tant sols amb ajuda del major augment del triquinoscopi, cal procedir a un examen posterior amb ajuda d'un microscopi.

Aquest examen microscòpic, s'ha de fer de manera que cada preparació sigui examinada lenta i acuradament, amb un augment de 30 a 40 vegades.

En cas de dubte, cal prosseguir l'examen amb altres mostres i preparacions, si és necessari, amb augments superiors fins a obtenir les precisions desitjades.

L'examen triquinoscòpic no ha de durar menys de 3 minuts.

En cas d'utilitzar mostres de reserva procedents de la part del diafragma situada prop de les costelles o l'estèrnum, de la musculatura de la llengua o dels músculs mastegadors o, fins i tot, dels músculs abdominals, l'examen triquinoscòpic ha de durar, almenys, 6 minuts.

El temps mínim establert per a l'examen triquinoscòpic, no inclou el temps necessari per a la preparació de les mostres, ni tampoc, el temps emprat per a la confecció de les preparacions.

2. Mètode de la digestió artificial

a) Instrumental i material: Ganivet per a tallar les mostres. Estereomicroscopi (augment de 15 a 40 vegades) que disposi d'una il·luminació adequada. Petits recipients numerats que puguin tancar-se per a la conservació de les mostres, si escau, fins a la repetició dels exàmens. Estufa. Embut de vidre de dos a tres litres amb suport i tub de connexió de cautxú i pinces per separar el tub de connexió. Tamís de plàstic (diàmetre de 18 centímetres aproximadament, malles d'1 mil·límetre aproximadament). Sedàs. Tub afusat de punta soldada. Cubeta. Picadora de carn. Líquid de digestió compost de la manera següent: 10 grams de pepsina [80 U/g FIP (Federació Internacional de Farmàcia)], 5 mil·lilitres de HCl (37% almenys), portar a un litre amb aigua corrent.

b) Preparació de les mostres: Quan les mostres procedeixin d'animals sencers (canals), cal agafar aproximadament 20 grams d'un dels pilars del diafragma en la zona de transició entre la part muscular i la part tendinosa. En cas que no hi hagi pilar del diafragma, cal agafar la mateixa quantitat de mostra en la part del diafragma situada prop de les costelles o dels músculs de la llengua o dels músculs mastegadors, o fins i tot, dels músculs de la paret abdominal. Quan les mostres procedeixin de trossos de carn, cal agafar aproximadament 20 grams del múscul esquelètic que contingui poc greix, i en la mesura del possible, prop dels ossos i tendons.

c) Mètode: Per a l'examen d'una mostra col·lectiva procedent de 10 animals, s'agafa una mostra que pesi 10 grams de cada mostra individual. La resta de cada una de les mostres s'ha de conservar per a un examen individual posterior quan s'estimi que pugui ser necessari. Es reuneixen 10 mostres de 10 grams cada una en una mostra col·lectiva, es piquen amb una picadora de carn (diàmetre dels forats 2 mil·límetres) i es col·loquen, sense aixafar, en el tamís proveït d'un sedàs. Se suspèn aleshores el tamís en un embut unit per un tros de tub de cautxú a un tub afusat de punta soldada. S'omple l'embut amb el líquid de digestió fins que el material d'anàlisi estigui completament recobert. La relació material d'anàlisi/líquid de digestió ha d'estar compresa entre 1/20 i 1/30 aproximadament. Després d'una incubació de 18 a 20 hores a una temperatura de 37 a 39 ºC, se separa el tub afusat i es procedeix a eliminar amb precaució el líquid que suri en aquest tub i a recollir en una càpsula el sediment, que s'ha d'aclarir (diluir) acuradament. Cal buscar la presència de triquines amb ajut de l'estereomicroscopi amb un augment de 20 a 40 vegades. En cas de resultat positiu o dubtós de l'anàlisi d'una mostra col·lectiva, cal analitzar individualment les mostres restants a les quals s'han d'afegir 20 grams agafats de cada animal o en cas que es tracti de trossos de carn, 20 grams agafats de cada tros.

3. Mètode de digestió artificial de mostres col·lectives

a) Instrumental i reactius: Un ganivet i pinces per agafar les mostres.

Una màquina de picar carn, els forats de la qual han de tenir un diàmetre comprès entre 2 i 3 mil·límetres.

Un matràs Erlenmeyer de 3 litres amb un tap de goma o de buata.

Un embut cònic de separació d'una capacitat de 2 litres.

Un suport normal amb el peu en forma de A de 28 centímetres de longitud, proveït d'una vareta de 80 centímetres.

Una anella de 10 a 11 centímetres que pugui fixar-se al suport.

Una pinça amb una boca esmussada (23/40 mil·límetres) que pugui subjectar- se al suport per mitjà d'un maniguet doble.

Un tamís (finor de la malla: 177 micres) d'un diàmetre exterior d'11 centímetres proveït d'una reixeta de llautó o d'acer inoxidable.

Un embut d'un diàmetre interior de com a mínim 12 centímetres.

Provetes graduades de 100 mil·lilitres.

Un estereomicroscopi (augment de 15 a 40 vegades), que disposi d'una il·luminació adequada, o un triquinoscopi, proveït d'una taula horitzontal per al compressor, que disposi d'una il·luminació adequada.

En cas d'utilització del triquinoscopi: una cubeta per al còmput de larves, que es pot descriure de la manera següent: una cubeta formada per plaques acríliques d'un gruix de 3 mil·límetres i que reuneixi les característiques següents: fons de la cubeta: 180 x 40 mil·límetres, dividit en quadrats; plaques laterals: 230 x 20 mil·límetres; plaques frontals: 40 x 20 mil·límetres.

El fons i les plaques frontals han d'estar fixos entre les plaques laterals, de manera que formin una cubeta proveïda de 2 petites nanses en els dos extrems.

La part superior del fons ha d'estar entre 7 i 9 mil·límetres més elevada en relació amb la base del quadrat format per les plaques laterals i frontals.

Les plaques han de fixar-se per mitjà d'una cola adequada al material.

En cas d'utilització de l'estereomicroscopi, una sèrie de plaques de Petri d'un diàmetre de 9 centímetres, el fons de les quals ha de dividir-se en quadrats d'examen de 10 x 10 mil·límetres, mitjançant un instrument punxegut.

Diversos recipients d'un volum de 10 litres que s'han d'utilitzar en el moment de la descontaminació dels instruments, per mitjà d'un tractament (per exemple el formol), i per al suc digestiu que quedi, en el cas de resultat positiu.

Àcid clorhídric concentrat almenys al 37 %.

Concentració de pepsina: 1:10.000 NF (US National Formulary), corresponent a 1:12.500 BP (British Pharmacopea), corresponent a 2.000 FIP (Federació Internacional de Farmàcia).

Un nombre de safates que puguin contenir 50 mostres, d'aproximadament 2 grams cada una.

Una balança de precisió de 0,1 gram.

b) Preparació de les mostres: Quan les mostres procedeixin d'animals sencers (canals), cal agafar aproximadament 2 grams d'un dels pilars del diafragma en la zona de transició entre la part muscular i la part tendinosa. En cas que no hi hagi pilar del diafragma, cal agafar la mateixa quantitat de mostra en la part del diafragma situada prop de les costelles o dels músculs de la llengua o dels músculs mastegadors, o fins i tot, dels músculs de la paret abdominal. Quan les mostres procedeixin de trossos de carn, cal agafar aproximadament 2 grams del múscul esquelètic que contingui poc greix, i en la mesura del possible, prop dels ossos i tendons.

c) Mètodes: Grups complets de mostres (100 a la vegada) S'agafa una mostra, d'aproximadament 1 gram de cada una de les 100 mostres individuals procedents dels animals. La mostra col·lectiva es passa una vegada per la màquina de picar carn. La carn picada es col·loca en el matràs Erlenmeyer de 3 litres, al mateix temps que 7 grams de pepsina i es cobreix amb 2 litres d'aigua de l'aixeta escalfada a una temperatura aproximada de 40-41 ºC, amb 25 mil·lilitres d'àcid clorhídric concentrat. Cal agitar la mescla per dissoldre la pepsina. El pH de la solució és, aleshores, d'aproximadament 1,5 a

2. Per a la digestió, el matràs Erlenmeyer es col·loca en una estufa a 40-41ºC durant 4 hores aproximadament.

Durant aquest temps, s'agita regularment com a mínim, dues vegades per hora.

Digerida la solució, es filtra, per mitjà d'un tamís, a través de l'embut cònic de separació de 2 litres i es deixa en repòs sobre el suport durant almenys una hora.

Trafegar a una proveta graduada, un volum total d'aproximadament 45 mil·lilitres, i distribuir en tres plaques de Petri, els fons de les quals han d'estar dividits en quadrats, a raó de 15 mil·lilitres per placa.

Cada placa de Petri s'ha d'examinar minuciosament a l'estereomicroscopi, per tal de descobrir-hi les larves.

En el cas que s'utilitzin cubetes per al còmput de larves, els 45 mil·lilitres es distribueixen en dues cubetes i s'han d'examinar al triquinoscopi.

Les larves apareixen en el sediment com uns organismes identificables i si l'aigua és tèbia, sovint es poden observar els enrotllats i desenrotllats de l'espiral.

Els líquids de digestió s'han d'examinar des del moment en què es preparin.

En cap cas no es pot postergar l'examen per a l'endemà.

Si els líquids de digestió no són prou transparents o si no s'examinen en el termini de 30 minuts següents a la seva preparació, s'han de clarificar (diluir) de la manera següent: vessar la mostra final de 45 mil·lilitres a una proveta graduada i deixar sedimentar durant 10 minuts.

Seguidament, aspirar 30 mil·lilitres del líquid que sura i afegir aigua de l'aixeta als 15 mil·lilitres restants fins a obtenir un volum total de 45 ml.

Després d'un nou període de repòs de 10 minuts aspirar novament 30 mil·lilitres del líquid que sura i vessar els 15 mil·lilitres restants a una placa de Petri, o a una cubeta per al còmput de les larves, en vistes a practicar el corresponen examen.

Rentar la proveta graduada amb 10 mil·lilitres d'aigua de l'aixeta i afegir el líquid obtingut a la placa de Petri o a la cubeta per al còmput de larves.

Procedir a practicar l'examen.

Grups de menys de 100 mostres Es pot afegir un màxim de 15 mostres individuals a un grup complet de 100 mostres per examinar-les al mateix temps que aquestes últimes.

Si el nombre de mostres que s'han d'examinar és superior a 15 i inferior a 100, el líquid de digestió s'ha de reduir proporcionalment.

En el cas que surti un resultat positiu o dubtós de l'examen d'una mostra col·lectiva, s'ha d'agafar una mostra de 20 grams de cada animal, d'acord amb les indicacions previstes a l'apartat

b) anterior. Les mostres de 20 grams procedents de 5 animals s'han de reunir i examinar d'acord amb el mètode descrit. D'aquesta manera, s'han d'examinar les mostres de 20 grups de 5 animals. Si es descobreixen triquines en un grup de mostres de 5 animals, s'han d'agafar mostres de 20 grams de cada animal que pertanyi a aquest grup i s'han d'examinar d'acord amb el mètode descrit.

4. Mètode de la digestió de mostres col·lectives amb assistència mecànica i tècnica de la sedimentació

a) Instrumental i reactius: Un ganivet o tisores per a tallar les mostres.

Safates dividides en 50 quadrats que puguin contenir, cada una, les mostres de carn, d'aproximadament 2 grams.

Un Stomacher Lab-blender 3 500, Thermo model.

Bosses de plàstic adaptades al Stomacher Lab-blender.

Embuts de separació cònics amb una capacitat de 2 litres, preferentment proveïts de claus de seguretat de tefló.

Suports amb anelles i fixacions.

Tamisos (finor de malla 177 micres) d'un diàmetre exterior d'11 centímetres proveïts d'una reixa d'acer inoxidable.

Embuts d'un diàmetre interior d'almenys 12 centímetres, destinats a la recepció dels tamisos.

Provetes graduades de 100 mil·lilitres.

Un dosificador de 25 mil·lilitres.

Gots de precipitat d'una capacitat de 3 litres.

Una cullera o una vareta de vidre per a agitar el líquid de digestió en el got de precipitat.

Una xeringa de plàstic i un tub d'aspiració.

Una cullera graduada de 6 grams.

Un termòmetre d'una precisió de ± 0,5 ºC amb una graduació d'1 a 100 ºC.

Un vibrador.

Un relé que s'encengui i apagui a cada minut.

Un triquinoscopi proveït d'una taula horitzontal o un estereomicroscopi que disposi d'una il·luminació adequada.

Una cubeta per al còmput de larves (en el cas que s'utilitzi un triquinoscopi).

La cubeta ha d'estar formada per plaques acríliques d'un gruix de 3 mm i ha de presentar les característiques següents: fons de la cubeta: 180 x 40 mil·límetres dividit en quadrats. plaques laterals: 230 x 20 mil·límetres. plaques frontals: 40 x 20 mil·límetres.

El fons i les plaques frontals han de ser fixos entre les plaques laterals, de manera que formin dues petites nanses en els dos extrems.

La part superior del fons ha d'estar entre 7 i 9 mil·límetres més elevada en relació amb la base del quadrat format per les plaques laterals i frontals.

Cal fixar les plaques per mitjà d'una cola adequada al material.

En el cas que s'utilitzi un estereomicroscopi, diverses plaques de Petri d'un diàmetre de 9 centímetres, el fons de les quals ha d'estar dividit en quadrats de 10 x 10 mil·límetres, mitjançant un instrument punxegut.

Solució d'àcid clorhídric concentrat al 17,5 %.

Concentració de pepsina: 1:10.000 NF (US National Formulary), corresponent a 1:12.500 BP (British Pharmacopea), corresponent a 2.000 FIP (Federació Internacional de Farmàcia).

Diversos recipients o cubells de 10 litres que s'han d'utilitzar en el moment de la descontaminació de l'instrumental, per mitjà d'un tractament (com per exemple el formol) i per al suc digestiu que quedi, en el cas de resultat positiu.

Una balança de precisió de 0,1 gram.

b) Preparació de les mostres: Quan les canals siguin senceres, s'agafa una mostra d'aproximadament 2 grams, d'un dels pilars del diafragma, a la zona de transició entre la part muscular i la part tendinosa. Si no hi ha pilar del diafragma, s'agafa la mateixa quantitat de la part del diafragma situada prop de les costelles o de l'estèrnum, o de la musculatura de la llengua, o dels músculs mastegadors, o també de la musculatura abdominal. Per als trossos de carn, s'agafa una mostra d'aproximadament 2 grams de múscul esquelètic que contingui poc greix, i en la mesura del possible, prop dels ossos o dels tendons.

c) Mètode:

1. Procediment de digestió Grups complets de mostres (100 a la vegada) S'equipa el Stomacher Lab-blender 3 500 amb una doble bossa de plàstic i es regula la temperatura a 40-41 ºC.

Es posa un litre i mig d'aigua escalfada a 32-35 ºC en la bossa interior i es duu a 40-41 ºC.

Es transfereix a la bossa 25 mil·lilitres de la solució d'àcid clorhídric al 17,5%.

A continuació s'afegeixen 100 mostres d'1 gram cada una (a 25-30 ºC) agafades de cada una de les mostres individuals, d'acord amb el procediment previst a l'apartat b).

Finalment s'afegeixen 6 grams de pepsina.

Cal respectar escrupolosament l'ordre de les operacions per evitar la descomposició de la pepsina.

Barrejar i triturar al Stomacher durant 25 minuts.

Treure la bossa de plàstic del Stomacher, filtrar el líquid de digestió amb l'ajuda d'un tamís i deixar que s'escorri en un got de precipitats de 3 litres.

Rentar la bossa de plàstic amb 100 mil·lilitres d'aigua, que s'ha d'utilitzar a continuació per esbandir el tamís i afegir-ho al filtrat que contingui el got de precipitats.

Es poden afegir com a màxim 15 mostres individuals al grup complet de 100 mostres per ser examinades al mateix temps que aquestes.

Grups de menys de 100 mostres Equipar el Stomacher Lab-blender 3 500 d'una doble bossa de plàstic i regular la temperatura a 40-41 ºC.

Preparar un líquid de digestió barrejant un litre i mig d'aigua i 25 mil·lilitres d'àcid clorhídric al 17,5 %.

Afegir 6 grams de pepsina i barrejar-ho tot a una temperatura de 40-41ºC.

Cal respectar escrupolosament l'ordre de les operacions per evitar la descomposició de la pepsina.

S'ha de determinar un volum de líquid de digestió que es correspongui a 15 mil·lilitres per mostra (així doncs, per a 30 mostres, s'ha de preparar 30 x 15 mil·lilitres = 450 mil·lilitres) i transferir-ho a la bossa de plàstic interior, al mateix temps que les mostres de carn d'aproximadament 1 gram (a 25 - 30 ºC) agafades de cada una de les mostres individuals, segons el procediment descrit en l'apartat

b) anterior. Buidar l'aigua a aproximadament 41 ºC, a la bossa exterior fins a obtenir un volum total a les dues bosses d'un litre i mig. Barrejar i triturar al Stomacher durant 25 minuts. Treure la bossa de plàstic del Stomacher, filtrar el líquid de digestió amb l'ajuda d'un tamís i deixar que s'escorri en un got de precipitats de 3 litres. Rentar la bossa de plàstic amb 100 mil·lilitres d'aigua, que s'ha d'utilitzar a continuació per aclarir el tamís i afegir-ho al filtrat que contingui el got de precipitats.

2. Aïllament de les larves per sedimentació Cal afegir al líquid de digestió 300-400 grams de gel en laminetes, o de gel triturat per obtenir un volum de 2 litres aproximadament.

S'agita fins que el gel es fongui.

En el cas de grups de menys de 100 mostres, la quantitat de gel s'ha de reduir proporcionalment.

Traspassar el líquid de digestió refredat a un embut de separació de 2 litres proveït d'un vibrador que s'ha de fixar per mitjà d'una pinça suplementària.

Per a la sedimentació, deixar el líquid a l'embut de separació durant 30 minuts, alternant un minut de vibració i un minut de pausa.

Després dels 30 minuts, introduir ràpidament 60 mil·lilitres de sediment a una proveta graduada de 100 mil·lilitres.

Després de la seva utilització, cal esbandir l'embut amb una solució detergent.

Deixar reposar la mostra de 60 mil·lilitres i aspirar el líquid que suri fins deixar a la proveta un volum de 15 mil·lilitres que s'han d'examinar per investigar la presència de larves.

Per a l'aspiració, s'ha d'utilitzar una xeringa de plàstic d'un sol ús proveïda d'un tub de plàstic.

La longitud del tub ha de permetre que a la proveta graduada quedin 15 mil·lilitres del líquid quan el coll de la xeringa es trobi al nivell del voral del cilindre.

Introduir els 15 mil·lilitres que queden en una cubeta per al còmput de larves o en dues plaques de Petri i examinar-les al triquinoscopi o a l'estereomicroscopi.

Els líquids de digestió s'han d'examinar des del moment en què estiguin preparats.

En cap cas no es pot posposar l'examen per al dia següent.

Si els líquids de digestió no són prou transparents o si no s'examinen en els 30 minuts següents a la seva preparació s'han de clarificar (diluir) de la manera següent: s'ha d'abocar la mostra final de 60 mil·lilitres a una proveta graduada i deixar sedimentar durant 10 minuts.

Després d'aquest temps, cal treure per aspiració 45 mil·lilitres del líquid que sura i afegir aigua de l'aixeta als 15 mil·lilitres restants fins obtenir un volum total de 45 mil·lilitres.

Després d'un nou període de repòs de 10 minuts, aspirar 30 mil·lilitres del líquid que suri, vessar els 15 mil·lilitres restants en una placa de Petri o en una cubeta per al còmput de les larves i procedir a practicar el corresponen examen.

La proveta graduada s'ha de rentar amb 10 mil·lilitres d'aigua de l'aixeta i el líquid obtingut cal afegir-lo a la mostra a la placa de Petri o a la cubeta per al còmput de larves prèviament a la pràctica de l'examen.

En el cas que s'obtingui un resultat positiu o dubtós a l'examen d'una mostra col·lectiva, s'ha d'agafar una mostra de 20 grams, de cada animal, d'acord amb les indicacions previstes a l'apartat

b) anterior. S'han de reunir mostres de 20 grams procedents de 5 animals i examinar-les d'acord amb el mètode descrit més amunt. D'aquesta manera s'han d'examinar les mostres de 20 grups de 5 animals. Si es descobreixen les triquines en un grup de mostres de 5 animals, s'han d'agafar mostres de 20 grams de cada animal que pertanyin a aquest grup i s'han d'examinar d'acord amb el mètode descrit més amunt.

5. Mètode de la digestió de mostres col·lectives amb assistència mecànica i tècnica d'aïllament per filtració

a) Instrumental i reactius: Els mateixos que els de l'apartat

a) del punt 4 anterior, i a més: Un embut Gelman d'un litre amb suport per a filtre (diàmetre del suport 45 mil·límetres). Una reixa rodona d'acer inoxidable (finor de malla de 35 micres) i un diàmetre del disc de 45 mil·límetres. Dues anelles de goma d'1 mil·límetre de gruix amb un diàmetre interior de 38 mil·límetres. La reixa s'ha de col·locar entre les anelles i s'ha de fixar amb una cola de dos components que s'adapti als dos materials (acer inoxidable i goma). Un matràs Erlenmeyer de 3 litres amb un tub lateral per a aspiració. Una bomba de filtració. Bosses petites de plàstic amb una capacitat mínima de 80 mil·lilitres. Un sac de sosa "Rennilase" 1:150.000 unitats "Soxlet" per gram.

b) Preparació de les mostres: Vegeu apartat

b) del punt 4 anterior.

c) Mètode:

1. Procediment de digestió Per grups complets de mostres (100 a la vegada) i per grups de grups de menys de 100 mostres vegeu els respectius paràgrafs del punt 1 de l'apartat

c) del mètode detallat en el punt 4 del present annex.

2. Aïllament de les larves per filtració Afegir al líquid de digestió 300-400 grams de gel en laminetes o de gel triturat per obtenir un volum d'aproximadament 2 litres.

En el cas de grups de menys de 100 mostres, la quantitat de gel ha de reduir-se proporcionalment.

Agitar el líquid de digestió fins que el gel es fongui.

Deixar reposar el líquid de digestió refredat durant almenys 3 minuts, perquè les larves puguin enrotllar-se.

Col·locar l'embut Gelman proveït d'un suport per a filtre, en el qual es troba un disc filtrant, sobre un matràs Erlenmeyer connectat a una bomba de filtració.

Introduir el líquid de digestió a l'embut Gelman i filtrar.

Cap al final, es pot accelerar el pas del líquid a través del filtre procedint a una aspiració amb la bomba de filtració.

S'ha d'acabar l'aspiració exactament abans que el filtre s'assequi, és a dir, quan quedin entre 2 i 5 mil·lilitres de líquid a l'embut.

Després de la filtració de tot el líquid de digestió, s'ha de treure el disc filtrant i col·locar-lo en una bossa de plàstic de 80 mil·lilitres afegint-hi de 15 a 20 mil·lilitres de solució de "Rennilase".

Per obtenir la solució de "Rennilase" s'han d'introduir 2 grams de "Rennilase" en 100 mil·lilitres d'aigua de l'aixeta.

Practicar una doble soldadura a la bossa de plàstic i col·locar-la al Stomacher entre la bossa interior i la bossa exterior.

Triturar al Stomacher durant 3 minuts, per exemple; mentrestant, l'aparell s'utilitza per a l'anàlisi d'un grup complet o incomplet de mostres.

Després de 3 minuts, cal treure del Stomacher la bosseta de plàstic que conté el disc filtrant i la solució de "Rennilase" i obrir-la amb unes tisores.

S'ha d'introduir el líquid en una cubeta per al còmput de les larves o en una placa de Petri.

Rentar la bosseta amb 5 o 10 mil·lilitres d'aigua, que s'ha d'introduir a continuació a la cubeta per a la triquinoscòpia, o a una placa de Petri per a l'examen en l'estereomicroscopi.

Els líquids de digestió han d'examinar-se des del moment en què estiguin preparats.

En cap cas no es pot posposar l'examen per a l'endemà.

És important no emprar mai discos filtrants que no estiguin perfectament nets i no assecar mai discos filtrants si no estan nets.

Per netejar els discos, cal deixar-los en una solució de "Rennilase" durant almenys 8 hores.

Abans d'utilitzar-los, s'han de rentar al Stomacher en una solució de "Rennilase".

En el cas que el resultat de l'examen d'una mostra col·lectiva sigui positiu o dubtós, s'ha d'agafar una mostra de 20 grams de cada animal, d'acord amb les indicacions previstes a l'apartat

b) anterior. S'han de reunir les mostres de 20 grams procedents de 5 animals i examinar-les d'acord amb el mètode descrit. D'aquesta manera, s'han d'examinar les mostres de 20 grups de 5 animals. Si es descobrissin triquines en un grup de mostres de 5 animals, s'han d'agafar mostres de 20 grams de cada animal que pertanyi a aquest grup i s'han d'examinar d'acord amb el mètode descrit.

6. Mètode de la digestió de mostres col·lectives amb utilització d'un agitador magnètic

a) Instrumental i reactius: Un ganivet i pinces per a agafar les mostres.

Safates dividides en 50 quadrats que puguin contenir, cada un, mostres de carn de 2 grams aproximadament.

Un molinet.

Un agitador magnètic proveït d'una placa tèrmica de temperatura controlada i una barra magnètica (recoberta de tefló) de 5 centímetres aproximadament.

Embuts de separació cònics amb una capacitat de 2 litres.

Suports amb anelles i fixacions.

Tamisos (finor de malla de 177 micres) d'un diàmetre exterior d'11 centímetres proveïts d'una reixa d'acer inoxidable.

Embuts d'un diàmetre interior mínim de 12 centímetres, destinats a rebre el tamís.

Un got de precipitats de 3 litres.

Provetes graduades amb una capacitat aproximada de 50 mil·lilitres o tubs de centrifugació.

Un triquinoscopi d'una taula horitzontal o un estereomicroscopi que disposi d'una il·luminació adequada.

Una cubeta per al còmput de larves (si es fa servir un triquinoscopi).

La cubeta ha d'estar formada per plaques acríliques d'un gruix de 3 mm i ha de presentar les característiques següents: fons de la cubeta: 180 x 40 mil·límetres dividit en quadrats. plaques laterals: 230 x 20 mil·límetres. plaques frontals: 40 x 20 mil·límetres.

El fons i les plaques frontals han d'estar fixats entre les plaques laterals de manera que formin dues petites nanses en els dos extrems.

La part superior del fons ha de ser entre 7 i 9 mil·límetres més elevada en relació amb la base del quadrat format per les plaques laterals i frontals.

Cal fixar les plaques amb una cola adequada al material.

Diverses plaques de Petri en el cas que s'utilitzi un estereomicroscopi, el fons de les quals s'ha de dividir en quadrats de 10 x 10 mil·límetres, mitjançant un instrument punxegut.

Un full d'alumini.

Àcid clorhídric al 25 %.

Concentració de pepsina: 1:10.000 NF (US National Formulary) corresponent a 1:12.500 BP (British Pharmacopea) corresponent a 2.000 FIP (Federació Internacional de Farmàcia).

Aigua de l'aixeta escalfada a una temperatura de 46-48 ºC.

Diversos cubells de 10 litres que s'han d'utilitzar en el moment de la descontaminació de l'instrumental per mitjà d'un tractament (per exemple el formol) i pel suc digestiu que quedi en el cas que el resultat sigui positiu.

Una balança de precisió de 0,1 gram.

b) Preparació de les mostres: Quan les canals estan senceres, s'agafa una mostra d'aproximadament 2 grams, en un dels pilars del diafragma a la zona de transició entre la part muscular i la part tendinosa. Si no hi ha pilar del diafragma, s'agafa la mateixa quantitat de mostra de la part del diafragma situada prop de les costelles o de l'estèrnum o de la musculatura de la llengua, o dels músculs mastegadors, o bé de la musculatura abdominal. Per als trossos de carn, s'agafa una mostra, d'aproximadament 2 grams, als músculs esquelètics que continguin poc greix i, en la mesura del possible, prop dels ossos o dels tendons.

c) Mètode: Grups complets de mostres (100 a la vegada) Triturar al molinet 100 mostres, d'aproximadament 1 gram, agafades de cada mostra individual, d'acord amb les indicacions de l'apartat

b) anterior.

S'ha de fer funcionar l'aparell tres o quatre vegades durant un segon.

Posar la carn picada en un got de precipitat de 3 litres i empolvorar-la amb 10 grams de pepsina.

S'introdueix al got de precipitat 2 litres d'aigua de l'aixeta escalfada a una temperatura de 46-48 ºC i s'hi afegeix 16 mil·lilitres d'àcid clorhídric.

Introduir diverses vegades el dispositiu de triturat del molinet al líquid de digestió que es trobi al got de precipitats per treure'n les substàncies que hi puguin quedar adherides.

Col·locar la barra magnètica al got de precipitat i cobrir amb un full d'alumini.

Col·locar el got de precipitat a la placa preescalfada de l'agitador magnètic i iniciar l'agitació.

Abans de començar el procés d'agitació, s'ha de regular l'agitador magnètic de manera que, durant el funcionament, pugui mantenir-se a una temperatura constant de 44-47 ºC.

Durant el procés d'agitació, el líquid de digestió ha de girar a una velocitat prou elevada de manera que es formi un profund remolí central, però sense provocar esquitxades.

S'agita el líquid de digestió durant 30 minuts i s'atura l'aparell.

Es filtra el líquid de digestió a través d'un tamís col·locat en un embut i es recull el filtrat en un embut de separació.

Deixar reposar el líquid de digestió a l'embut de separació durant 30 minuts i posteriorment traspassar ràpidament una mostra de 40 mil·lilitres de líquid de digestió a la proveta graduada o al tub de centrifugació.

Deixar reposar la mostra de 40 mil·lilitres durant 10 minuts i a continuació aspirar 30 mil·lilitres del líquid que suri, deixant un volum de 10 mil·lilitres.

La mostra de 10 mil·lilitres del sediment restant es vessa en una cubeta per al còmput de larves o en una placa de Petri.

Esbandir la proveta graduada o el tub de centrifugació amb aproximadament 10 mil·lilitres d'aigua d'aixeta que s'afegeixen a la mostra directament a la cubeta de còmput de larves o a la placa de Petri.

A continuació, procedir a observar al triquinoscopi o a examinar a l'estereomicroscopi, segons el cas.

Els líquids de digestió han d'observar-se des del moment en què estiguin preparats.

En cap cas no es pot posposar l'examen per al dia següent.

Si els líquids de digestió no s'examinen en el termini de 30 minuts següents a la seva preparació, s'han de clarificar (diluir) de la manera següent: s'ha de vessar la mostra final, d'aproximadament 40 mil·lilitres, en una proveta graduada i deixar sedimentar durant 10 minuts.

Després d'aquest temps, s'han de treure 30 mil·lilitres del líquid que suri per tal d'obtenir un volum de 10 mil·lilitres.

Aquest volum es fa arribar a 40 mil·lilitres amb aigua de l'aixeta.

Després d'un nou període de repòs de 10 minuts, aspirar 30 mil·lilitres del líquid que sura per a obtenir un volum de 10 mil·lilitres que s'han d'examinar en una placa de Petri, o en una cubeta pel còmput de larves.

Rentar la proveta graduada amb 10 mil·lilitres d'aigua de l'aixeta i afegir-los a la placa de Petri, o a la cubeta per al còmput de larves i posteriorment procedir a realitzar l'examen.

Si l'examen revela que el sediment no és clar, s'ha d'abocar la mostra a una proveta graduada i amb aigua de l'aixeta s'ha de fer arribar el seu volum a 40 mil·lilitres aplicant novament el mètode esmentat més amunt.

Grups de menys de 100 mostres Eventualment, es poden afegir 15 mostres d'1 gram cada una, a un grup de 100 mostres i es poden examinar al mateix temps que aquestes últimes, d'acord amb el mètode descrit per a un grup de mostres complet.

S'han d'examinar més de 15 mostres en qualitat de grup complet.

En el cas de grups que arribin fins a les 50 mostres, els líquids de digestió es poden reduir a 1 litre.

En el cas que el resultat de l'examen d'una mostra col·lectiva sigui positiu o dubtós, s'ha d'agafar una mostra de 20 grams de cada animal, d'acord amb les indicacions previstes a l'apartat

b) anterior. Les mostres de 20 grams, procedents d'animals, s'han de reunir i examinar d'acord amb el mètode descrit. D'aquesta forma s'han d'examinar les mostres de 20 grups de 5 animals. Si es detecten triquines en un grup de mostres de 5 animals s'han d'agafar mostres de 20 grams de cada animal que pertanyi a aquest grup i s'han d'examinar d'acord amb el mètode descrit.

7. Mètode de digestió automàtica de mostres col·lectives de fins a 35 grams

a) Instrumental i reactius: Ganivet o tisores per a tallar les mostres. Safates dividides en 50 quadrats que puguin contenir, cada un, mostres de carn de 2 grams aproximadament. Mesclador Trichomatic 35 amb peça de filtració. Solució d'àcid clorhídric al 8,5 % ± 0,5 % en pes. Filtres de membrana de policarbonat transparent de 50 mil·límetres de diàmetre amb porus de 14 micròmetres. Concentració de pepsina 1:10.000 NF (US National Formulary), corresponent a 1:12.500 BP (British Pharmacopea), corresponent a 2.000 FIP (Federació Internacional de Farmàcia). Balança de precisió de 0,1 gram. Pinces planes. Diversos portaobjectes de microscopi de 5 centímetres de costat com a mínim o diverses plaques de Petri d'almenys 6 centímetres de diàmetre, el fons de les quals han de dividir-se en quadrats de 10 x 10 mil·límetres mitjançant un instrument punxegut. Estereomicroscopi de transmissió de llum (de 15 a 60 augments) o triquinoscopi proveït d'una taula horitzontal. Cubell per a la recollida de líquids residuals Diversos recipients de 10 litres que s'han d'utilitzar en el moment de la desinfecció de l'instrumental, per mitjà d'un tractament (com per exemple el formol), i pel suc digestiu sobrant, en el cas de resultat positiu.

b) Preparació de les mostres: Quan les canals estiguin senceres, s'agafa una mostra, d'aproximadament 2 grams d'un dels pilars del diafragma, a la zona de transició entre la part muscular i la part tendinosa. Si no hi ha pilar del diafragma, s'agafa la mateixa quantitat de la banda costal de l'estèrnum, d'una part del diafragma, dels músculs mastegadors, o bé de la musculatura abdominal. Per als trossos de carn, s'agafa una mostra, d'aproximadament 2 grams dels músculs esquelètics que continguin poc greix i, en la mesura del possible, prop dels ossos o dels tendons.

c) Mètode:

1. Procediment de digestió Es col·loca el mesclador amb la peça de filtració, es connecta al tub de desguàs i es condueix el tub al cubell de residus.

En encendre el mesclador, s'inicia l'escalfament.

Abans de començar, s'ha d'obrir i tancar la vàlvula del fons situada sota la cambra de reacció.

A continuació, s'ha d'afegir un màxim de 35 mostres d'aproximadament 1 gram cada una (a 25-30 ºC) agafades de cada una de les diferents mostres, segons el que disposa l'apartat b).

Cal assegurar-se que s'han eliminat els trossos de tendó més grans, ja que poden obstruir el filtre de membrana.

Omplir d'aigua, la cambra de líquids connectada al mesclador, fins al voral (400 mil·lilitres aproximadament).

Abocar aproximadament 30 mil·lilitres d'àcid clorhídric (8,5 %), fins al voral de la cambra de líquids més petita, que també ha d'estar connectada.

Col·locar un filtre de membrana sota el filtre gruixut al suport per al filtre de la peça de filtració.

Finalment, afegir 7 grams de pepsina.

Cal respectar escrupolosament l'ordre de les operacions per evitar la descomposició de la pepsina.

Tancar la tapa de la cambra de reacció i de líquids.

Seleccionar el temps de duració de la digestió.

Un període de digestió curt (5 minuts), en el cas de porcs en edat normal de sacrifici, i un període perllongat (8 minuts) per a la resta de mostres.

La digestió automàtica comença en prémer el botó de posada en marxa del mesclador (la digestió i la filtració subsegüent tenen lloc de forma automàtica).

El procés finalitza entre 10 i 13 minuts després i s'atura automàticament.

Obrir la tapa de la cambra de reacció i comprovar que aquesta és buida.

Si a la cambra hi ha escuma o líquids de digestió, cal repetir el procediment que es descriu al punt 5 següent.

2. Aïllament de les larves Desmuntar el suport per a filtre i traslladar el filtre de membrana a un portaobjectes o a una placa de Petri. Examinar el filtre de membrana amb microscopi o triquinoscopi.

3. Neteja del material En el cas que el resultat sigui positiu, cal omplir d'aigua bullint dos terços de la cambra de reacció del mesclador. S'omple d'aigua corrent la cambra de líquids connectora fins cobrir el sensor de nivell inferior. A continuació té lloc el programa automàtic de neteja. Es desinfecta el suport per a filtre i la resta de material, per exemple, utilitzant formol. Quan acabi la jornada laboral, s'ha d'omplir d'aigua la cambra de líquids del mesclador i portar a terme un programa estàndard.

4. Ús de filtres de membrana: Cada filtre de membrana de policarbonat no es pot utilitzar més de cinc vegades. S'ha de donar la volta al filtre després de cada ús. També després de cada ús, s'ha de comprovar que el filtre no hagi sofert cap dany que el faci inservible.

5. Mètode que ha d'aplicar-se quan la digestió sigui incompleta i, en conseqüència, no es pugui efectuar la filtració: Quan s'efectuï el procediment automàtic del mesclador de conformitat amb el punt 1, si en obrir la tapa de la cambra de reacció es comprova que hi ha escuma o líquid, cal portar a terme el procediment següent: Tancar la vàlvula del fons, situada sota la cambra de reacció. Desmuntar el suport per a filtre i traslladar el filtre de membrana a un portaobjectes o a una placa de Petri. Posar un nou filtre de membrana en el suport per a filtre i muntar aquest suport. Omplir d'aigua la cambra de líquids del mesclador fins cobrir el sensor de nivell inferior. Portar a terme el programa automàtic de neteja. Quan hagi finalitzat el programa de neteja, obrir la tapa de la cambra de reacció i comprovar si hi ha restes de líquid. Si la cambra és buida, desmuntar el suport per a filtre i traslladar el filtre de membrana, amb l'ajut d'unes pinces, a un portaobjectes o una placa de Petri. Examinar els dos filtres de membrana de conformitat amb el que disposa el punt 2 anterior. Si no és possible examinar els filtres, repetir tot el procediment de digestió aplicant un període de digestió perllongat, de conformitat amb el descrit en el punt 1 anterior.

6. Actuació en cas de resultats positius o dubtosos: Si els resultats de l'examen d'una mostra col·lectiva són positius o dubtosos, s'agafen un altre cop mostres de 20 grams de cada un dels animals, d'acord amb el procediment descrit a l'apartat

b) anterior. Aquestes mostres s'han d'examinar separadament, d'acord amb el mètode descrit.

Capítol II. Condicions que han de complir els centres o laboratoris de detecció de triquines

Els centre o laboratoris que realitzin anàlisis per a la detecció de triquina, han de comptar almenys, amb els equipaments mínims següents:

a) Instal·lacions de subministrament d'aigua potable freda i calenta en quantitat suficient a les necessitats requerides.

b) Un local equipat per confeccionar les preparacions. Les parets, el terra i en general les superfícies de treball han de ser llises i estar revestides amb materials que en permetin una fàcil neteja i desinfecció.

c) Equips de ventilació suficient i, si és necessari, d'una instal·lació d'aire condicionat que permeti aconseguir una temperatura ambient que no superi els 25 ºC.

d) Il·luminació natural o artificial suficient que no modifiqui els colors. Ha d'evitar-se la llum solar intensa.

e) Equips per a la neteja i la desinfecció de les mans del personal, proveïts d'aigua potable corrent freda i calenta, de productes de neteja i desinfecció i d'un sistema d'eixugamans d'un sòl ús.

f) Instal·lació o equipament frigorífic per conservar les mostres de carn que es recepcionin.

g) Instal·lació o equipament frigorífic que garanteixi la conservació de les mostres de carn en condicions de congelació a una temperatura de com a mínim - 18 ºC durant almenys 3 mesos.

h) Un bany o una pica de dimensions suficients per a la neteja i desinfecció del material d'examen.

i) Vestidors, lavabos així com d'excusats equipats amb cisterna. Els lavabos han d'estar proveïts amb aigua potable corrent freda i calenta, productes de neteja i sistemes d'eixugamans d'un sol ús.

j) Recipients estancs, que resisteixin la corrosió, proveïts de tapes que tanquin hermèticament, concebuts per impedir que s'agafi qualsevol cosa no autoritzada del seu contingut, destinats a recollir les restes de les mostres analitzades.

2. Altres disposicions aplicables al personal, als locals i material dels laboratoris de detecció de triquines:

a) Mantenir en tot moment un estat de neteja absoluta, del personal, del laboratori, dels locals, del material i dels instruments.

b) El personal ha de portar roba de treball d'ús exclusiu, neta i rentar-se les mans diverses vegades durant una mateixa jornada de treball, així com cada vegada que es reinicien les tasques d'anàlisi.

c) Als laboratoris de detecció de triquines no hi pot entrar cap animal.

d) El material i els instruments utilitzats per a la feina han de conservar-se en bon estat de manteniment i de neteja. Ha de netejar-se i desinfectar-se acuradament, si escau diverses vegades durant una mateixa jornada de treball i almenys al final de les operacions de cada jornada de treball.

Capítol III. Disposicions relatives als triquinoscopis

La concepció i el tipus de triquinoscopis han de respondre als criteris mínims següents:

1. Facilitat d'ús.

2. Il·luminació potent: els resultats del control han de ser segurs fins i tot si els locals no es troben completament a les fosques. La font lluminosa ha de ser un làmpada de projecció de 100 W (12 V).

3. Augments suficients: per al treball normal són necessaris 50 augments. Per a una identificació segura dels objectes que no siguin clarament identificables amb els augments de treball normal, són necessaris de 80 a 100 augments.

4. Poder separador: cada augment ha de donar una imatge clara, precisa i de color net.

5. Dispositiu de commutació: qualsevol canvi d'augment ha d'anar acompanyat d'un ajust automàtic de la lluminositat de la imatge.

6. Augment del contrast: el condensador ha d'estar equipat amb un diafragma d'iris que permeti reforçar els contrastos per a l'examen profund dels casos dubtosos. El diafragma d'iris ha de ser de regulació fàcil, per exemple per mitjà d'una palanca de control fixada a la taula del triquinoscopi.

7. Facilitat d'enfocament: enfocament ràpid per mitjà d'anella reguladora o enfocament fix per mitjà de palanca de comandament.

8. Regulació de la tensió que permeti obtenir la lluminositat desitjada en qualsevol situació.

9. Desplaçament del compressor en sentit únic: sistema de bloqueig automàtic que ha de garantir el desplaçament del compressor en un sol sentit per impedir qualsevol desplaçament intempestiu o imprevist.

10. Camp visual lliure en direcció a la superfície de projecció.

11. Superfície de projecció d'un diàmetre de 54 centímetres com a mínim, amb un alt poder de reflexió i duradora.

12. Desmuntable a fi de facilitar les operacions de neteja i manteniment.